A.
Judul
Pewarnaan Gram
B.
Tujuan Praktikum
Untuk mempelajari cara pewarnaan gram dan mengamati
bentuk serta sifat bakteri terhadap
pewarnaan gram
C. DASAR
TEORI
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah
suatu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, gram-positif
dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding
sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans
Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella
pneumoniae (Anonim, 2008).
Pada tahun 1883, Christian Gram, seorang
ahli bakteriologi dari Denmark menemukan metode pewarnaan bakteri secara tidak
sengaja. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan deferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan ini
merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri.
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi
kelompok Gram-positif dan kelompok Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna
ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet yodium tetap dipertahankan
meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri Gram-negatif berwarna karena
kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian
mengambil zat warna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan
perbedaan struktur kedua kelompok bakteri tersebut.
Pewarnaan Gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan
segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan
penympangan hasil pewarnaan Gram. Karena pada biakan tua banyak sel mengalami
kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat
warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa
bakteri Gram-positif dengan dinding yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan
kompleks warna kristal violet yodium sehingga terlihat sebagai bakteri
Gram-negatif.
Zat warna pada umumnya dapat dibagi
menjadi 2 golongan yakni pewarna bersifat basa. Prosedur pewarnaan yang
menghasilkan pewarnaan mikroba dinamakan
pewarna positif. Dalam prosedur ini dapat digunakan zat warna yang bermuatan positif
maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pewarnaan negatif
latar belakang disekeliling milroba untuk meningkatkan kontraks dengan mikroba
yang tidak berwarna. Zat warna atau cat biologi adalah persenyawaan yng
mempunyi gugusan Komatofor dan Auxokrom yang terikat dalam suatu cincin
benzene.
Tujuan pewarnaan banyak senyawa
organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk
pemeriksaan mikroskopi. Prosedur-prosedur pewarnaan untuk :
·
Mengamati dengan lebih
baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar
·
Mengidentifikasi
bagian-bagian struktural sel mikroorganisme
·
Membantu
mengidentifikasi dan/ataw membedakan organisme yang serupa
Pewarnaan diferensial, prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau
bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial .
Faktor-faktor yang mempengaruhi
pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Preparat yang sudah meresap suatu
zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan
ciri yang khas bagi suatu spesies.
Sejumlah besar koloni bakteri dan fungi
menarik perhatian oleh warnanya yang mencolok, disebabkan karena terjadi
eksresi zat warna ke dalam medium atau fermentasi sel. Kemampuan membentuk zat
warna terfiksasi secara genetik, dan demikian merupakan penanda khusus.
Bentuk-bentuk pewarna mudah dikenal dan ditentukan identitasnya, zat warna
dapat merupakan derivat dari berbagai kelas; karotenoid zat warna fenazin, zat
warna pirol, azakuinon dan antosian.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua
golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat
warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka
disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin,
netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-,
CH3COO-, COOHCOO‑. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa
lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh
faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
1. Peluntur
zat warna
Pelunturan
zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang telah di
warnai. Peluntur zat warna (decolorizer) berfungsi untuk menghasilkan
kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan antara
sel denagan zat warna dikenal beberapa istilah misalnya tahan asam, tahan
alkohol, tahan air, dan lain-lain
Ada beberapa macam peluntur zat antara lain yaitua;
ü Pluntur
zat warna bersifat asam misalnya HCL, HNO3, dan camputan asam
tersebut dengan alcohol.
ü Peluntur
bersifat basa yakni KOH, NaOH,sabun dan garam-garam.
ü Peluntur
zat warna yang lemah yaitu alcohol, air, minyak cengke, aseton, dan gliserin.
ü Garam logam berat misalnya AgNO3,CuSO4,
dll
ü Garam logam ringan misalnya Na2SO4, MgSO4.
Dll.
2. Intensifikasi
Pewarnaan
Zat
warna dapat diintensifikasi dengan beberapa cara misalnya dengan mempertiggi
kadar zat warna, mempertinggi temperature pewarnaan (60 – 900C) dan
menambahkan suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabakan
sel-sel mikroba dapat diwarnai leih intensif atau zat warna terikat lebih kuat
pada jaringan sel.
Ada beberapa jenis mordan, yakni:
ü Mordan
basa, yaitu mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam yang berwarna
seperti FeSO4, kalium antimonium tartrat, dan asetil piridinium
klorida.
ü Modan
asam, yaitu mordan yang bereaksi dengaan zat warna basa. Misalnya asam tannin,
asam pikrat, dan lain-lain.
3. Pewarnaan
garam
Christian
Gram, seorang ahli bakteriologi Denmark secara kebetulan menemukan suatu
pewarnaan betingkat, yang dinamakan pewarnaan gram. Pewarnaan ini merupakan
salah satu prosedur yang penting, yang banyak digunakan dalam laboratorium
biologi.
Pewarnaan
gram memilahkan bakteri menjadi dua kelompok yakni bakteri gram positif dan
gram negative. Gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna
Kristal violet iodium tetap dipertahankan meskipun dilarutan pemucat. Sedangkan
bakteri gram negative berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut
sewaktu pemberian larutan pemucat. Penyebab perbedaan gram dimungkinkan karena
komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram
negative. Ada beberapa factor yang mempengaruhi laju lepasnya kompleks warna
ungu Kristal iodium pada sel bakteri pada langka pemucatan. Mikroba kelompok
gram positif dapat memperlihatkan cirri gram negatif bila mengalami pemucatan
yang berlebihan.
Penyebab
pebedaan gram dimungkinkan karena komposisi dinding sel bakteri gram positif
berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih tebal paa bakteri
gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol dan asteon. Larutannya lipid oleh
zat pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori
dinding sel dan inilah penyebah proses pemucatan atau dinding sel gram negatif
lebih cepat.
D.
Alat dan Bahan
1.
Alat
|
No.
|
Nama
|
Gambar
|
Fungsi
|
|
1.
|
Gelas benda
|
 |
Untuk melekatkan
preparat/sediaan yang akan dilihat di mikroskop
|
|
2.
|
Lampu
spritus
|
 |
Sebagai bahan yang
mensterilkan bahan praktikum
|
|
3.
|
Ose
|
 |
Untuk
mengambil koloni suatu mikroba dan untuk inokulasi
|
|
4.
|
Mikroskop
|
 |
Untuk
memanaskan dan mensterilkan jarum inokulasi atau sengkelit
|
2.
Bahan
|
No.
|
Nama
|
Gambar
|
Fungsi
|
|
1.
|
Biakan Murni
(eschericia coli)
|
 |
Sebagai
sampel
|
|
2.
|
Gram A
(larutan kristal violet)
|
 |
Sebagai
pewarna pada sampel
|
|
3.
|
Gram B
(larutan mordan lugol dan iodin)
|
 |
Sebagai
pewarna pada sampel
|
|
4.
|
Gram C (larutan
peluntur (aseton-alkohol) )
|
 |
Sebagai
pewarna pada sampel
|
|
5.
|
Gram D
(larutan cat safranin)
|
 |
Sebagai
pewarna pada sampel
|
|
6.
|
Alkohol 70%
|
 |
Untuk
mensetrilkan alat
|
E.
Prosedur kerja
1.
Membersihkan
gelas benda dengan alkohol, kemudian menganggangnya diatas nyala lampu spritus.
2.
Mengambil
dengan ose secara aseptis 1 lup suspensis bakteri dan meletakkan diatas gelas
benda tersebut. Meratakan suspensi tersebut kira-kira seluas 1 cm2
dan mengeringanginkanya.
3.
Melakukan fiksasi
diatas nyala lampu spritus.
4.
Mebubuhkan cat utama
(2-3 tetes gram A) pada permukaan preparat lapisan tipis bakteri sampai
tertutup semua. mendiamkan
selama 1 menit.
5. Mencuci
dengan air yang mengalir dan mengeringanginkanya.
6. Membubuhkan
larutan Mordan (gram B) dan mendiamkan selama 1 menit, cuci dengan air
7. Kemudian
mencucinya lagi dengan peluntur (gram C) sampai lapisan nampak pucat (30
detik), dan langsung di cuci kembali dengan air mengalir dan
mengeringanginkannya.
8. Meneteskan
cat penutup (Gram D) dan membiarkan selama 2 menit. Kemudian mencuci kembali
dengan air mengalir dan mengeringanginkannya.
9. Megamati
dengan mikroskop perbesaran kuat (100x10) dan memberi minyak imersi.
10. Menggambar
dan memberi keterangan bakteri yang tampak serta memperhatikan bentuk, warna,
dan reaksi pengecatan. Bakteri Gram
positif berwarna ungu, sedangkan bakteri gram Negatif berwarna merah.
F.
Hasil
Pengamatan
|
Perbesaran
10 x 100
NA udara
Berbentuk Kokus
|
 |
G. Pembahasan
Pada percobaan ini, yang pertama dilakukan adalah
mengambil biakan bakteri dan meletakkan pada gelas objek yang sudah dibersihkan
terlebih dahulu. Begitupun dengan jarum ose, harus dilakukan pembakaran
terlebih dahulu sebelum menggunakan jarum ose. Setelah itu, meratakan sampel kemudian difiksasi.
Setelah melakukan fiksasi, pewarnaan mulai dilakukan yaitu pertama dengan
meneteskan gram A (kristal violet) pada permukaan preparat kemudian meratakan
sampai tertutupi oleh kristal violet tersebut. Setelah 1 menit, preparat dicuci
dengan air mengalir sampai bersih. Kemudian melanjutkan pewarnaan dengan
meneteskan gram B (mordan lugol dan lodin) dan mendiamkan selama 1 menit
kemudian preparat dicuci dengan air mengalir, setelah bersih dilanjutkan dengan
meneteskan gram C (larutan
peluntur) dan didiamkan selama 30
detik kemudian dicuci dengan air mengalir. Dan terakhir adalah meneteskan gram
D (larutan safranin) pada
permukaan preparat, setelah itu dicuci dengan air mengalir. Dan langsung
mencuci dengan air mengalir. Setelah selesai melakukan pewarnaan, sediaan diamati
dengan mikroskop.
Kemudian dilihat di bawah mikroskop
engan pebesaran 100x10 agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah. Berdasarkan praktikum yang
telah dilakukan diketahui bahwa koloni yang diambil dari hasil biakan pada media
merupakan gram positif. Ini didasarkan pada hasil akhir
pewarnaan yang menghasilkan warna ungu. Bakteri positif
atau gram positif dinding selnya memiliki struktur yang
lebih tebal sehingga tetap berwarna ungu, sedangkan pada gram negative memiliki struktur dinding sel yang lebih tipis sehingga
warnanya akan pudar ketika dicuci dengan alkohol.
H. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan
maka dapat disimpulkan bahwa organisme yang yang
dapat menahan zat pewarna setelah dicuci
dengan alkohol disebut organisme gram positif, dimana
indikasinya menunjukkan warna ungu pada bakteri itu sendiri.
Sedangkan organisme
yang tidak dapat menahan zat pewarna setelah dicuci
dengan alkohol disebut organisme
gram negative dimana
indikasinya menunjukkan warna merah pada bakteri itu sendiri.
I. Jawaban Tugas
Soal
Jelaskan mekanisme terjadinya
perbedaan warna pada bakteri!
Jawab
Gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna Kristal
violet iodium tetap dipertahankan meskipun dilarutan pemucat. Sedangkan bakteri
gram negative berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu
pemberian larutan pemucat. Penyebab pebedaan gram dimungkinkan karena komposisi
dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding
sel yang lebih tebal paa bakteri gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol
dan asteon. Larutannya lipid oleh zat pemucat yang digunakan dalam pewarnaan
gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah penyebah proses
pemucatan atau dinding sel gram negatif lebih cepat.
Daftar Pustaka
Anonim. 2008.
Mengenal Lebih Dekat Lactobasillus. (internet). Tersedia: (http//www.ruangkeluarga.com..) [30 April 2015]
Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet, and M. Wooton.
1987. Ilmu Pangan. Jakarta: Universitas
Indonesia Press.
Michael. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi.. Jakarta:
Penerbit Universitas negeri indonesia.
Sugiharto, Bowo. 2008. Menggagas Penerapan Bioteknologi Berbasis Mikroba. (internet). Tersedia: (http//www.google.com.) [30 April 2015]
Team Teaching. 2015. Penuntun
Praktikum Mikrobiologi dan Parasitologi.
Laboratorium Kesehatan Masyarakat UNG
Waluyo, Lud. 2008. Teknik
Metode
Dasar
Mikrobiologi. Malang: UMM Press
Tidak ada komentar:
Posting Komentar